Phylogenetic tree

Assignment 2
Who are the ancestors of the dinosaurs?

DNA was extracted from 80-million-year-old bone fragments found in strata of the Upper Cretaceous Blackhawk Formation in the roof of an underground coal mine in eastern Utah.
The authors conclude that the DNA sequence,

cccttctattattcattctcattctattcgttattcttgtactccacacatccaaacaac aaagcataatattccacccattgagtccattcctatcctgattcttagtccccgaacctt
ttacactcacatg

appears to be from a dinosaur that lived 80 million years ago.

Show us step by step of how to do phylogenetic analysis with cytochrome b sequences. Use these following species
o Human
o Dog
o Rabbit
o rhinoceros
o dugong
o mouse
o whale
o bovine
o sicklebill
o chicken
o magpie
o frog

Step 1
1.เชื่อม Internet ไปยังเว็บไซต์ NCBI:http:www.ncbi.nlm.nih.gov โดยเลือกสิ่งที่ต้องการค้นหา คือ nucleotide และใส่ keyword ลงไป

การค้นหาและการเลือก sequences

1.ใส่คำค้นชื่อสิ่งที่ต้องการหาเป็นภาษาลาตินและ sequences ที่ใช้จะเลือกใช้ แต่ Ref. sequ. ที่เป็น complete genome จาก mitochondrion เช่นเราต้องการค้นหา sequence ของ Human จะได้ว่า Human --> “Homo sapiens AND cytochrome b AND reference sequence”

2.สำหรับสิ่งมีชีวิตที่ไม่สามารถหา mitochondrion complete genome โดยเฉพาะ cytochrome b ก็จะเลือกใช้ข้อมูลที่สมบรูณ์ที่สุด โดยตัดคำว่า reference sequence ออกจากการหา

Keyword
•Human : Homo sapiens NC_001807
•Dog: Canis lupus familiaris NC_002008
•Rabbit : Bunolagus monticularis AY292718
Pentalagus furnessi AY292720
Oryctolagus cuniculus NC_001913
•Rhinoceros :Rhinoceros unicornis NC_001779
•Dugong : Dugong dugon NC_003314
•Mouse :Mus musculus NC_005089
•Bovine :Bubalus bubalis NC_006295
Bos indicus NC_005971
•Frog : Polypedates megacephalus NC_006408
Rana nigromaculata NC_002805
•Chicken: Gallus gallus NC_001323
•Whale : Eschrichtius robustus NC_005270
•Sicklebill :Epimachus albertisi U15205
•Magpie :Cyanopica cyanus pallescens AY701179

2. Search NCBI for cytochrome b nucleotide sequence of 12 different species

3. Click เลือกที่ Display > GenBank----> Text แล้ว copy เก็บไว้ในโปรแกรม Notepad

4. Click เลือกที่Display > FASTA format เพื่อให้ NCBI รายงานผลในรูป FASTA format แล้ว copy เก็บเอาในโปรแกรม Notepad เพื่อนำไปทำการจัดเรียงดับเบส

Step 2

การติดตั้งโปรแกรม BioEdit
1. เชื่อม Internet ไปยังเว็บไซต์ http://www.google.com/ 2. ดาวน์โหลดโปรแกรมโดยการเลือกคลิกที่หัวข้อ BioEdit.zip (Full install)

3. โปรแกรมจะถูกติดตั้งอยู่ใน drive C ซึ่งสามารถเรียกใช้งานโดยผ่านทาง
คำสั่ง Start ----> program ---> BioEdit --> BioEdit

Step 3

การใช้งานของโปรแกรม BioEdit

1. Manual alignment of sequences จะแสดงหน้าต่างการทำงานพื้นฐาน ดังรูป

2. เลือกคลิกที่ File ---> New Alignment ---> Import

3. เปิด FASTA file ที่เก็บอยู่ในโปรแกรม Notepad

3.1 เมื่อเข้า Import --------> sequence alingment file

-Dinosour - Mouse
-Dog - Dugong
-Rabit 1 - Frog 1
-Rabit 2 - Frog 2
-Rabit 3 - Chicken
-Magpie - Gray whale
-Sicklebil - Bovine 1
-Rhinoceres - Bovine 2
-Human
3.2 จะได้ sequence ดังภาพที่แสดง


4.จากนั้นให้เลือกไปที่คำสั่งในเมนู Accessory Application--> ClustalW Multiple alignment ---> Run ClustalW

5. รอให้โปรแกรม Run

6.จากนั้น จะได้ Alignment ---->save text ---->Accessory Application แล้วเข้าไปที่ DNAmk DNA Maximum likelihood program with molecular clock

7.จะได้ Data ดังภาพ หลังจากนั้น save as text file

8.เปิดโปรแกรม Tree view แล้วเปิด file ที่save ไว้ก่อนหน้านั้น

9.โปรแกรมจะเริ่มทำงานและรายงานผลออกมาในรูปแบบ graphic ของ phylogenetic tree

Haploview

Find out

1. How many haplotype blocks in this region of Chromosome X?
2. Could you find out the tagging SNP in each haplotype block?

I. เปิดโปรแกรม Haploview 4.0 ซึ่งสามารถ download โปรแกรมดังกล่าวได้จาก http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/download.php โดยโปรแกรมดังกล่าวต้องการโปรแกรม java ในการทำงานควบคู่ไปด้วย

1. ขั้นตอนการติดตั้งโปรแกรม JAVA




Instructions for Downloading Java on Windows - Internet Explorer

• You might need to click the yellow warning bar at the top of the browser window show the installation.

• Click Install to start the installation proces

If you do not get the window asking you whether you want to install the software, please see the help page or the Manual Download page.

The installation process starts. The installer presents an option to view the License Agreement. After reading the agreement, click the Accept button to accept its terms and to continue with the installation.

If you selected the Advanced Options Panel, the installer displays a Custom Setup screen that allows you to choose program features to set up. We recommend that you keep the default settings, unless you are an advanced user who wants more precise control over the components that will be installed. After ensuring that the desired program features are selected, click the Next button to continue with the installation

• Once the installation is successfully completed, you will see the Verify Installation page where you can verify your Java version installation
  
  2 แสดงการ Download Haploview 4.0 จาก http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/download.php

II. เตรียมข้อมูลที่จะใช้ในการลง Data ของ Hapmap format

• Copy Data มาเปิดใน Microsoft Word

• Save Data แบบ Plain text
  
  
  
  III . เมื่อเปิดโปรแกรม Haploview จะพบหน้าต่าง Welcome to HaploView
  
• แสดงหน้าต่างเมื่อเข้าสู่โปรแกรม Haploview ดังภาพ

• ที่หน้าต่าง Welcome to HaploView เลือกที่คำสั่ง HapMap Download

ตั้งค่า Release เป็น 21
เลือก Chromosome ที่ต้องการศึกษา ซึ่งในที่นี้คือ Chromosome X
เลือกกลุ่มประชากรที่ต้องการศึกษา ซึ่งในที่นี้เลือก CHB+JPT จากนั้นกดเลือก ok เพื่อเริ่มต้นการทำงาน

• เลือก HapMap Format เพื่อ download File แล้วคลิก OK

• Change HW p-value cut off to 0.05 แล้วคลิกที่ Rescore Markers

• หลังจากที่โปรแกรมทำงานจะปรากฏหน้าต่าง Check Markers ดังภาพ

• จากนั้นเลือกที่หน้าต่าง Haplotypes ซึ่งจะแสดงผลลัพธ์ดังภาพ
  
  


• แสดงหน้าต่างผลลัพทธ์ในหน้า LD Plot

How many haplotype blocks in this region of Chromosome X?ภายหลังจากได้ผลลัพธ์ในหน้าต่าง Haplotypes เปิดหน้าต่างผลลัพธ์ของ LD Plot




•สรุปว่ามี 3 haplotype blocks คือ
- Block 1 ตำแหน่งที่ 8, 9
- Block 2 ตำแหน่งที่ 13, 14, 15, 16, 17
- Block 3 ตำแหน่งที่ 24, 25, 26, 27, 28, 29


IV. Could you find out the tagging SNP in each haplotype block?

ภายหลังจากได้ผลลัพธ์ในหน้าต่าง Haplotypes เพื่อแสดง tagging SNP ในแต่ละ haplotype block เลือกคำสั่ง Display กดเลือก Show tags in blocks จะปรากฏดังภาพ

แสดงหน้าต่าง Haplotype block ที่แสดง tagging SNP

•สรุปว่ามี tagging SNP คือ
Block 1 มี tagging SNP ที่ตำแหน่ง 8,9
Block 2 มี tagging SNP ที่ตำแหน่ง 13,15
Block 3 มี tagging SNP ที่ตำแหน่ง 24,27